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日期:2018-09-12 / 人氣:

厭氧菌需有較低的氧化—還原勢能才能生長(例如破傷風梭狀芽孢杆菌需氧化—還原電勢降低至0.11V時才開始生長),在有氧的環境下,培養基的氧化—還原電勢較高,不适于厭氧菌的生長。爲使培養基降低勢,降低培養環境的氧壓是十分必要的。現有的厭氧培養法甚多,主要有生物學,化學和物理學3種方法,可根據各實驗室的具體情況而選用。 
1.生物學方法     
    培養基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發芽谷物等)或動物組織(新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等),由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣,碎肉培養基的應用,就是根據這個原理),組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢下降。      
    另外,将厭氧菌與需氧菌共同培養在一個平皿内,利用需氧菌的生長将氧消耗後,使厭氧菌能生長。其方法是将培養皿的一半接種吸收氧氣能力強的需氧菌(如枯草杆菌),另一半接種厭氧菌,接種後将平皿倒扣在一塊玻璃板上,并用石蠟密封,置37恒溫箱中培養2~3d後,即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先後生長。  
2.化學方法      
    利用還原作用強的化學物質,将環境或培養基内的氧氣吸收,或用還原氧化型物質,降低氧化—還原電勢。   
(1)李伏夫(B.M.JIbbob)法      
    此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣,其反應式如下:
    Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02      
   取一有蓋的玻璃罐,罐底墊一薄層棉花,将接種好的平皿重疊正放于罐内(如系液體培養基,則直立于罐内),最上端保留可容納1~2個平皿的空間(視玻罐的體積而定),按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g,在紙上混勻後,盛于上面的空平皿中,加水少許使混合物潮濕,但不可過濕,以免罐内水分過多。若用無蓋玻罐,則可将平皿重疊正放在淺底容器上,以無蓋玻罐罩于皿上,罐口周圍用膠泥或水銀封閉(如圖1-5)。  
(2)焦性沒食子酸法   焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣,同時由淡棕變爲深棕色的焦性沒食臍(Purpurgallin)。每l00cm3空間用焦性沒食子酸1g及10%氫氧化納或氫氧化鉀l0ml,其具體方法主要有下列幾種: 
(1)單個培養皿法:将厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊,中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片,在其上放焦性沒食子酸0.2g及10%NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋,将培養皿倒置于其上,周圍以融化石蠟或膠泥密封。将此玻璃板連同培養皿放人37C溫箱培養24~48h後,取出觀察。   
(2)Buchner氏試管法:取一大試管,在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數個或放一螺旋狀鉛絲。将已接種的培養管放人大試管中,迅速加入20%NaOH溶液0.5ml,立即将管口用橡皮塞塞緊,必要時周圍封以石蠟,37培養24~48h後觀察。 
(3)玻罐或幹燥器法:置适量焦性沒食子酸于一幹燥器或玻罐的隔板下面,将培養皿或試管置于隔板上,并在玻罐内置美藍指示劑一管,從罐側加入氫氧化鈉溶液放于罐底,将焦性沒食子酸用紙或紗布包好,用線系住,暫勿與氫氧化鈉接觸,待一切準備好後.将線放下,使焦性沒食子酸落人氫 氧化納溶液中,立即将蓋蓋好;封緊,置溫箱中培養。 
(4)瑞(Wright)氏法:将已接種細菌的培養管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌後,塞人管中離培養基1~1.5cm處,置适量焦性沒食子酸于其上,加入10%NaOH溶液2ml,迅速用橡皮塞将管口塞緊,以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養。                       
(5)史(Spray)氏法:用厭氧培養皿,在皿底一邊置焦性沒食子酸,另一邊置氫氧化鈉溶液,将已接種的平皿翻蓋于皿上,并将接合處用膠泥或石蠟密封完全,然後搖動底部,使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合,置溫箱中培養。  
(6)平皿法:置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間,上面的平皿接種細菌,下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液,用膠泥封固後,置溫箱中培養。  
(7)硫乙醇酸鈉法   硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑,加入培養基中,能除去其中的氧或還原性物質,促使厭氧菌生長。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。  
  A.液體培養基法:将細菌種人含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養基中,37℃培養24~48h後觀察,本培養基中加美藍液作爲氧化還原的指示劑,在無氧條件下,美藍被還原成無色。  
 B.固體培養基法:常采用特殊構造的Brewer培養皿,可使厭氧菌在培養基表面生長而形成孤立的菌落;操作過程是先将Brewer氏皿幹熱滅菌,将溶化且冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養基傾人皿内。待瓊脂冷   凝後,将厭氧菌接種于培養基的中央部分。蓋上皿蓋,使皿蓋内緣與培養基外圍部分相互緊密接觸。此時皿蓋與培養基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養基中的硫乙醇酸鈉還原,故美藍應逐漸褪色,而外緣部分,因與大氣相通,故仍呈藍色。将Brewer氏培養皿置于37℃恒溫箱内,經過24~48h後觀察。  3.物理學方法     利用加熱、密封、抽氣等物理學方法,以驅除或隔絕環境及培養基中的氧氣,使其形成厭氧狀态,有利于厭氧菌的生長發育。    
(1)厭氧罐法 :
常用的厭氧罐有Brewer氏罐,Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐)。将接種好的厭氧菌培養皿依次放于厭氧罐中,先抽去部分空氣,代以氫氣至大氣壓。通電,使罐中殘存的氧與氫經鉑或钯的催化而化合成水,使罐内氧氣全部消失。将整個厭氧罐放人孵育箱培養。本法适用大量的厭氧菌培養。 
(2)真空幹燥器法 :
将欲培養的平皿或試管放人真空幹燥器中,開動抽氣機,抽至高度真空後,替代以氫、氮或二氧化碳氣體。将整個幹燥器放進孵育箱培養。  
(3)高層瓊脂法:       
 加熱融化高層瓊脂,冷至45℃左右接種厭氧菌,迅速混合均勻。冷凝後37℃培養,厭氧菌在近管底處生長。                           
(4)加熱密封法:       
将液體培養基放在阿諾氏蒸鍋内加熱l0min,驅除溶解于液體中的空氣,取出,迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌後,在培養基液面覆蓋一層約0.5cm的無菌凡士林石蠟,置37℃培養。此外,尚有搖振培養法,此處從略。  
(5)二氧化碳培養法:      
少數細菌如布氏杆菌(牛型)等,孵育時,需大氣中添加5%~10%二氧化碳,方能使之生長繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養箱中進行培養;最簡單的二氧化碳培養法是在盛放培養物的有蓋玻璃缸内,燃點蠟燭,當火焰熄滅時,該缸的大氣中,就約增加了5%~10%的二氧化碳。也可用化學物質作用後生成二氧化碳,如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4%NaHCO3與30%H2SO4lmL,則可産生22.4mL的二氧化碳氣體。

作者:SAX


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